脊髓性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传病，居儿童致死性常染色体隐性遗传病的第2位。位于染色体5q11.2～q13.3上的运动神经元存活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致病基因。

　　人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN基因：端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2，两者仅有5个碱基不同。SMN1是主要功能基因，该基因突变可导致SMA发病，SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严重程度，其拷贝数增加可减轻SMA表型。目前已知约94％的SMA患者为SMN1基因第7和（或）第8外显子纯合缺失所致，少数病例可由SMN1基因点突变或小的缺失引起。

　　SMN1基因外显子缺失检测的意义

　　SMA在人群中的发病率为1/5000～1/10000，群体携带者频率为1/35～1/50，是出生缺陷的高危因素，因此极有必要进行SMA携带者的人群筛查，并通过产前诊断技术降低人群中SMA患儿的出生率。

　　临床上将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型、中间型和少年型，严重程度依次递减。神经专科医生一般根据患者发病年龄、临床表现及病情进展程度进行临床诊断，辅助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉活检，结合家族史和SMN1基因分析可进行确诊。由于SMA患儿中约94%为SMN1基因外显子纯合缺失，因此，SMN1基因缺失检测对于SMA的诊断具有更高的灵敏度和特异性。且对不同型的SMA患者，SMN1纯合缺失率没有显著差异，所以，SMN1纯合缺失的检测对于不同型SMA患者具有相同的临床诊断价值。在欧美人群中，SMN1基因纯合缺失检测已成为诊断和排除诊断SMA的首选方法。

　　SMN1基因缺失检测试剂的现状

　　目前，SMN1基因外显子缺失检测试剂较为缺乏，临床检验实验室较为公认的方法是PCR结合限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法。但该方法操作较为繁琐，且重复性差，不利于标准化，不易推广。同时，这种方法只能检测出纯合缺失，无法确认杂合缺失。

　　荷兰的SMAMLPA检测试剂可对待测靶序列进行半定量分析，因此既可检测纯合缺失，亦可确认杂合缺失。在国内外已有多篇文献报道采用该方法进行SMA患者诊断和SMA携带者筛查。但该产品目前仍为“仅用于研究”的试剂，尚未按照体外诊断类医疗器械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国家食品药品监管总局批准了第一项SMN1缺失突变检测试剂上市。该产品采用多重实时荧光MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因组单拷贝基因RPP40为内参基因，对SMN1基因第7外显子和第8外显子拷贝数进行相对定量检测，用于SMA患者的体外辅助分子诊断。SMN1基因外显子缺失检测的难点之一在于排除高同源性基因SMN2的干扰，特别是对于SMN2高拷贝数的受试者，需保证结果的准确可靠。该产品通过对实时荧光PCR相对定量、绝对定量技术进行系统整合，并在反应体系中加入特定化学组分，以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的错配，增加PCR扩增的特异性，从而有效控制SMN2基因非特异性扩增对检测结果的影响，准确检出高拷贝数SMN2样本中SMN1基因第7和第8外显子的缺失情况。

　　鉴于国内外尚无任何按照体外诊断试剂批准上市的SMA分子诊断产品，因此临床试验方案中依据EMQN关于《SMA分子诊断最佳实践指南》，采用了国内外SMA体外辅助分子诊断领域公认的PCR-RFLP法作为对照方法。临床试验共完成1069例，其中正常对照组777例，SMA病例组292例，统计分析结果显示申报产品与对比方法检测结果的一致性为100%（95%置信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年人大样本中目标外显子△△Ct分布范围的调查亦显示，该产品的纯合突变判断界值设置合理。

　　该试剂目前批准的预期用途仅包含纯合缺失的检测，尚不能用于杂合缺失的检测，因此无法用于SMA携带者的筛查，这是该产品的缺陷之一。

　　事实上，该产品在设计上已考虑到SMA携带者的检测，其检测原理是以待测样本中目标外显子荧光信号Ct值与内参基因荧光信号Ct值之差（△Ct_s），与正常对照品三个梯度稀释品中目标外显子荧光信号Ct值和内参基因荧光信号Ct值之差的平均值（△Ct_a）之差，即△△Ct，作为待测样本中目标外显子拷贝数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实时荧光定量PCR相对定量的基本数学原理推导得到申报产品检测变量△△Ct的计算公式，依据这一计算公式可推导出纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct理论值（或范围）；再结合目标外显子与内参基因扩增效率差异以及SMN2不同拷贝数的影响，可对上述△△Ct理论值进行优化。结果显示纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct值（或范围）之间可设置合理的判断界值，因此理论上该产品可分别检测出三种基因状态。但鉴于生产企业对杂合缺失与野生型之间的判断界值研究尚不透彻，再加上缺乏可判定杂合缺失的对比方法等其他困难，本次注册申请的预期用途仅限于检测纯合突变，即SMA患者辅助诊断。

　　综上，SMN1基因外显子缺失检测在SMA疾病诊断和SMA携带者筛查中具有重要的临床价值。然而到目前为止，受到技术水平的限制，相关的体外诊断试剂比较缺乏，特别是可用于SMA携带者筛查的杂合缺失检测，尚无适合的体外诊断试剂上市。（器审中心审评六部  何静云）

来源：中国医药报